2023年2月23日，北京大學(xué)程和平-王愛(ài)民團(tuán)隊(duì)在 Nature Methods 在線發(fā)表題為《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection》 的文章。文中報(bào)道了重量?jī)H為2.17克的微型化三光子顯微鏡，首次實(shí)現(xiàn)對(duì)自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經(jīng)元功能成像，為揭示大腦深部結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)機(jī)制開(kāi)啟了新的研究范式。

微型化三光子顯微鏡首次實(shí)現(xiàn)自由行為動(dòng)物非侵入式深腦成像

海馬體位于皮層和胼胝體下面，在短期記憶到長(zhǎng)期記憶的鞏固、空間記憶和情緒編碼等方面起重要作用。在嚙齒類動(dòng)物研究模型中，海馬距離腦表面深度大于一個(gè)毫米。由于大腦組織特別是胼胝體，具有對(duì)光的高散射光學(xué)特性，所以突破成像深度極限是長(zhǎng)期以來(lái)困擾神經(jīng)科學(xué)家的一個(gè)極大的挑戰(zhàn)。此前的微型化單光子及微型化多光子顯微鏡均無(wú)法實(shí)現(xiàn)穿透全皮層直接對(duì)海馬區(qū)進(jìn)行無(wú)損成像。

由于腦組織是高散射介質(zhì)，來(lái)自腦深層的熒光信號(hào)達(dá)到表面時(shí)已經(jīng)隨機(jī)散射。臺(tái)式三光子顯微鏡使用工作距離大于2mm、數(shù)值孔徑1.0的大尺寸物鏡，在滿足深層成像工作距離要求的同時(shí)保持足夠的熒光信號(hào)收集效率。但在微型探頭中，如果物鏡工作距離為2mm，使用大數(shù)值孔徑物鏡，探頭重量和體積就比較大，無(wú)法滿足自由行為小鼠對(duì)于探頭重量和體積的要求。

因此，解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵是在減小物鏡數(shù)值孔徑情況下，保持足夠的熒光收集效率。

此次微型化三光子顯微鏡的研發(fā)將經(jīng)典阿貝聚光鏡結(jié)構(gòu)引入探頭光學(xué)構(gòu)型設(shè)計(jì)中，將微型阿貝聚光鏡與簡(jiǎn)化的無(wú)限遠(yuǎn)物鏡密接以提高散射熒光收集效率，同時(shí)在激發(fā)光路引入李斯特物鏡作為管鏡補(bǔ)償簡(jiǎn)化物鏡的像差，并通過(guò)將阿貝聚光鏡與李斯特管鏡部分復(fù)用，實(shí)現(xiàn)探頭體積的減小。新微型化顯微鏡構(gòu)型在工作距離1.75mm、數(shù)值孔徑0.65、物鏡直徑僅3.4mm時(shí)，實(shí)現(xiàn)了與臺(tái)式三光子顯微鏡熒光收集效率相當(dāng)?shù)乃健?/p>

在全球，該微型化三光子顯微鏡首次實(shí)現(xiàn)了自由行為動(dòng)物非侵入式深腦成像解決方案，可穿透小鼠大腦全皮層和胼胝體，實(shí)現(xiàn)對(duì)海馬CA1亞區(qū)的直接觀測(cè)記錄，避免植入式Grin Lens損傷腦組織。神經(jīng)元鈣信號(hào)*大成像深度可達(dá)1.2mm，血管成像深度可達(dá)1.4mm。同時(shí)，微型化三光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)全皮層鈣信號(hào)成像僅需幾毫瓦，海馬鈣信號(hào)成像僅需20-50mw，大大低于組織損傷的安全閾值。

嶄露頭角——2.2克微型化雙光子顯微鏡，實(shí)現(xiàn)自由行為小鼠腦成像

在多光子成像領(lǐng)域，這支來(lái)自北大的團(tuán)隊(duì)已深耕多年。

2017年，程和平院士領(lǐng)導(dǎo)的北大交叉團(tuán)隊(duì)成功研制出**代2.2克微型化雙光子顯微鏡FHIRM-TPM，在全球首次實(shí)現(xiàn)了自由運(yùn)動(dòng)小鼠單個(gè)樹突棘水平神經(jīng)元功能活動(dòng)的高速、高分辨率實(shí)時(shí)成像。該微型化雙光子顯微鏡可實(shí)時(shí)記錄自由行為動(dòng)物的大腦神經(jīng)元和樹突棘活動(dòng)，支持鈣成像，并可在同一視野長(zhǎng)時(shí)程反復(fù)成像。

此前，在用臺(tái)式雙光子顯微鏡研究活體小鼠腦活動(dòng)時(shí)，需先麻醉小鼠并將其頭部固定。這種情況下，小鼠不能自由運(yùn)動(dòng)，無(wú)法研究如打斗、哺乳及社交行為，懸尾實(shí)驗(yàn)、電擊實(shí)驗(yàn)等研究受限。此外，臺(tái)式雙光子顯微鏡不便移動(dòng)且占用面積較大。

隨著科技的發(fā)展，部分研究人員引入虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)，在小鼠面前放一個(gè)顯示器，并將小鼠放在跑步機(jī)上，在跑的過(guò)程中投放虛擬場(chǎng)景并觀察小鼠腦活動(dòng)。但這種方法也飽受爭(zhēng)議。其一，在虛擬現(xiàn)實(shí)和現(xiàn)實(shí)情景中，小鼠大腦神經(jīng)元的反應(yīng)情況不一定完全相同；其二，動(dòng)物在頭部固定的情況下會(huì)有情緒上的壓力，還可能出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)。

據(jù)吳潤(rùn)龍介紹，北大團(tuán)隊(duì)的微型化雙光子顯微鏡主要有以下幾方面突破，一是飛秒激光的柔性傳輸，普通的光纖在傳輸飛秒激光時(shí)具有很強(qiáng)的色散和非線性效應(yīng)，導(dǎo)致雙光子激發(fā)效率變低，北大團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種新型空心光子晶體光纖，可以無(wú)失真地傳輸920nm飛秒激光，從而高效地進(jìn)行綠光熒光蛋白雙光子激發(fā)。

二是成像物鏡，傳統(tǒng)物鏡直徑在20mm左右，重量比一般小鼠還重，北大團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的微型物鏡直徑為3.5mm、長(zhǎng)10mm，內(nèi)部有上十個(gè)鏡片組合，分辨率依然可以達(dá)到衍射極限；三是高速成像，為了減少運(yùn)動(dòng)帶來(lái)的偽影，需要快速地進(jìn)行成像，北大團(tuán)隊(duì)通過(guò)高速M(fèi)EMS掃描振鏡，在微型化上實(shí)現(xiàn)了視頻級(jí)的成像速度。*后，各項(xiàng)技術(shù)的高質(zhì)量集成，構(gòu)成了2.2g的高時(shí)空分辨微型化雙光子探頭。

全球范圍內(nèi)，這款“戴著跑”的微型化雙光子顯微鏡**次實(shí)現(xiàn)了自由行為動(dòng)物的清晰穩(wěn)定成像，可用于在動(dòng)物覓食、跳臺(tái)、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學(xué)習(xí)前、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后，長(zhǎng)時(shí)程觀察神經(jīng)突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動(dòng)態(tài)變化，從而獲取小鼠在自由行為過(guò)程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)的動(dòng)態(tài)圖像。

諾貝爾生物學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者愛(ài)德華·莫索爾（Edvard.I. Moser）博士曾稱這款顯微鏡是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)“革命性”新工具。

持續(xù)深耕——拓寬腦科學(xué)研究的邊界，應(yīng)用場(chǎng)景不斷升級(jí)

2021年，這支北大團(tuán)隊(duì)推出了第二代微型化雙光子顯微鏡FHIRM-TPM 2.0，將成像視野擴(kuò)大了7.8倍，成像的橫向分辨率、軸向分辨率比**代顯微鏡高約1.5倍，同時(shí)具備獲取大腦皮層上千個(gè)神經(jīng)元功能信號(hào)的三維成像能力。

除在核心性能上實(shí)現(xiàn)升級(jí)外，新一代微型化雙光子顯微鏡采用整機(jī)一體化設(shè)計(jì)，滿足更小空間實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。同時(shí)具有較強(qiáng)的兼容性，內(nèi)置激光適配模塊，可匹配市面上所有品牌的飛秒激光器，以更強(qiáng)大的成像性能、更廣泛的適配性能及更便捷的操作性能為成像技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)新的活力。

基于微型化雙光子顯微鏡，北大團(tuán)隊(duì)與浙江大學(xué)的胡海嵐團(tuán)隊(duì)、中科院孫衍剛團(tuán)隊(duì)等開(kāi)展合作。如孫衍剛團(tuán)隊(duì)在研究癢覺(jué)感知神經(jīng)機(jī)制，由于癢覺(jué)出現(xiàn)過(guò)程非常快、神經(jīng)元發(fā)放也很快，而且不同比例的神經(jīng)元在癢覺(jué)感知的不同階段出現(xiàn)，這要求成像設(shè)備不僅需要快速記錄單個(gè)神經(jīng)元，還需具備高空間分辨率以區(qū)分兩類神經(jīng)元。

此前，大腦皮層對(duì)癢覺(jué)感知的編碼機(jī)制的研究多在麻醉動(dòng)物中進(jìn)行，這種情況下動(dòng)物無(wú)法通過(guò)抓撓行為報(bào)告對(duì)癢覺(jué)的感知。通過(guò)微型化雙光子顯微鏡，孫衍剛團(tuán)隊(duì)在小鼠自由活動(dòng)時(shí)實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞分辨率的鈣成像，為癢覺(jué)機(jī)制的研究提供了新的方案。

在應(yīng)用場(chǎng)景上，北大團(tuán)隊(duì)也一直在突破極限。2022年，團(tuán)隊(duì)攻克了航天極端環(huán)境機(jī)體應(yīng)激與防護(hù)等多項(xiàng)技術(shù)難題，研制出空間站雙光子顯微鏡。據(jù)程和平院士此前的介紹：“在軌實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備對(duì)可靠性、體積、重量、抗沖擊和振動(dòng)性能等有著更苛刻的要求，要想研制出能夠進(jìn)入太空的雙光子顯微鏡并非易事。”

近日，神舟十五號(hào)的航天員使用其空間站雙光子顯微鏡，成功獲取皮膚表皮及真皮淺層的三維圖像，可用于航天員的在軌健康監(jiān)測(cè)。

科研成果產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵一步，

搭建可控的供應(yīng)鏈

王愛(ài)民提出，由于綜合技術(shù)等原因，目前全球范圍內(nèi)為數(shù)不多的課題組在研究微型化雙光子顯微鏡，只有更多參與者加入，才能更快地推廣技術(shù)、做大產(chǎn)業(yè)。

創(chuàng)新技術(shù)的大規(guī)模推廣離不開(kāi)產(chǎn)業(yè)化。以中國(guó)科學(xué)院院士及北京大學(xué)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)和生理學(xué)等多學(xué)科專家為背景成立的北京超維景生物科技有限公司（以下簡(jiǎn)稱“超維景”）實(shí)現(xiàn)了科研成果的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化。目前，超維景在北京、南京兩地的團(tuán)隊(duì)人數(shù)已超100人，吸引了在生產(chǎn)、注冊(cè)、市場(chǎng)推廣等領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)豐富的產(chǎn)業(yè)人士加入。

從科研項(xiàng)目走向產(chǎn)業(yè)化，除了企業(yè)自身的技術(shù)積累、差異化產(chǎn)品創(chuàng)新、工藝流程控制外，可控的供應(yīng)鏈?zhǔn)顷P(guān)鍵因素之一。

據(jù)王愛(ài)民回憶，曾經(jīng)我們做的**個(gè)“商業(yè)化試水”的項(xiàng)目是雙光子光片顯微鏡，其中的一個(gè)核心部件變焦透鏡只有一家美國(guó)公司可以提供，在我們做科研、小范圍應(yīng)用時(shí)，可以正常買到，但當(dāng)我們決定產(chǎn)業(yè)化后，這家美國(guó)公司便不提供了，這也就直接導(dǎo)致項(xiàng)目“夭折”。

在此后的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中，超維景選擇“自力更生”加“內(nèi)外合力”的模式。一是自主研發(fā)逐步實(shí)現(xiàn)雙光子顯微鏡產(chǎn)品核心零部件國(guó)產(chǎn)化；二是聯(lián)合國(guó)內(nèi)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的參與者，由他們根據(jù)需求開(kāi)發(fā)新技術(shù)。

目前，超維景已建立起可控的產(chǎn)業(yè)鏈，如飛秒激光器、空心光纖、微型化物鏡等都已實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化，為公司后續(xù)醫(yī)療產(chǎn)品線的發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，不僅在研發(fā)、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)自主可控，還可大大降低生產(chǎn)成本。

兩條腿走路，

邁出科研設(shè)備的“舒適區(qū)”

王愛(ài)民提出：“中國(guó)腦科學(xué)起步較晚，市場(chǎng)不足美國(guó)的十分之一，但是2021年中國(guó)腦計(jì)劃正式啟動(dòng)，預(yù)計(jì)5年500億的投入。” 同時(shí)，雙光子顯微成像應(yīng)用于在體病理的研究和應(yīng)用工作在全球也開(kāi)展近20年，雙光子作為活體成像利器應(yīng)用于臨床診斷研究也展示了應(yīng)用潛力。超維景堅(jiān)持科研設(shè)備、醫(yī)療器械兩條腿走路，力求實(shí)現(xiàn)從動(dòng)物到人，更大程度地造福人體健康。

手持式皮膚生物細(xì)胞檢測(cè)儀是公司的首次“試水”。該產(chǎn)品以微型化雙光子顯微成像技術(shù)為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)在體、原位、無(wú)創(chuàng)、無(wú)標(biāo)記的微納米級(jí)顯微成像，細(xì)胞、彈性纖維、膠原纖維、代謝信息等清晰可見(jiàn)。

手持式皮膚生物細(xì)胞檢測(cè)儀主要有兩大應(yīng)用市場(chǎng)。一是臨床的應(yīng)用，在院內(nèi)進(jìn)行實(shí)時(shí)在體的檢測(cè)。目前院內(nèi)疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是病理檢查，需從人體切下一小塊組織送檢，操作有創(chuàng)且需等待一段時(shí)間（一般是3-5天）才能得到檢查結(jié)果。而很多情況下臨床需要快速?zèng)Q策、定期監(jiān)測(cè)，如黑色素瘤、皮膚癌等定期檢查。通過(guò)手持式皮膚生物細(xì)胞檢測(cè)儀，醫(yī)生可隨時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)的變化，觀察患者病情變化，以調(diào)整治療計(jì)劃。

二是皮膚功效檢測(cè)的應(yīng)用，超維景正在開(kāi)展皮膚圖譜研究，可用于化妝品、醫(yī)美技術(shù)的評(píng)估。據(jù)王愛(ài)民介紹，化妝品提到幫助改善肌膚狀態(tài)，但其中并沒(méi)有客觀標(biāo)準(zhǔn)，我們可直接基于對(duì)皮膚細(xì)胞的觀察，檢測(cè)其中的彈性纖維、膠原纖維，推出客觀的皮膚年齡標(biāo)準(zhǔn)，用于評(píng)估化妝品的有效性。

在醫(yī)療領(lǐng)域，超維景在開(kāi)發(fā)3D 4K熒光內(nèi)窺鏡，在傳統(tǒng)內(nèi)窺鏡的基礎(chǔ)上加入細(xì)胞成像功能，使醫(yī)生看到更多信息，進(jìn)一步推動(dòng)**診斷。

王愛(ài)民提到：“新技術(shù)的推廣市場(chǎng)教育非常重要，尤其是在保守謹(jǐn)慎的醫(yī)療市場(chǎng)。我們要先充分理解醫(yī)生的使用習(xí)慣再去設(shè)計(jì)產(chǎn)品，創(chuàng)新技術(shù)要變成對(duì)醫(yī)生而言真正好用的產(chǎn)品。”目前，超維景正在跟301醫(yī)院合作，開(kāi)發(fā)一次性內(nèi)窺鏡，用于消化道早癌的篩查、診斷；公司也在與協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科聯(lián)合開(kāi)展宮頸癌早篩方面的研究。

腦科學(xué)，無(wú)疑是近年來(lái)醫(yī)療領(lǐng)域*火的命題之一。

人類腦部結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜復(fù)雜，包含千億個(gè)神經(jīng)元，至今科學(xué)家都仍在探索情緒、感情等發(fā)生機(jī)制。成像技術(shù)是腦科學(xué)研究發(fā)展的關(guān)鍵。從CT、MRI到PET等成像技術(shù)，都是為做到“眼見(jiàn)為實(shí)”。人類不斷追求，在新鮮樣本、甚至是活體上直接進(jìn)行高分辨率成像。多光子顯微成像技術(shù)在成像分辨率、速度、深度等多方面具有較大優(yōu)勢(shì)，賦能腦科學(xué)研究。

同時(shí)將進(jìn)一步揭示腦疾病發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)檢測(cè)治療方法的開(kāi)發(fā)。如癲癇、帕金森、阿爾茲海默等神經(jīng)系統(tǒng)疾病所帶來(lái)的社會(huì)負(fù)擔(dān)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，且持續(xù)周期長(zhǎng)，缺少有效的治療手段。如果能在疾病機(jī)制上有一些新的發(fā)現(xiàn)，做到早防早治，可極大地減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)。

再者，成像技術(shù)必將與數(shù)字技術(shù)特別是人工智能技術(shù)緊密結(jié)合，“AI+”的成像系統(tǒng)將進(jìn)一步提高臨床醫(yī)生的診療水平。

綜合來(lái)看，多光子顯微成像技術(shù)擁有“科研+臨床”的廣闊應(yīng)用空間，將成為人類在腦科學(xué)研究海域中的一座燈塔，照亮更多隱秘的角落。

參考文章：

《你為什么會(huì)癢？中科院研究揭示癢覺(jué)表征和感知的神經(jīng)機(jī)制》——澎湃新聞

《【科技前沿】北京大學(xué)程和平/王愛(ài)民團(tuán)隊(duì)研制成功微型化三光子顯微鏡》——中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)

《多光子顯微成像技術(shù)在腦部疾病研究中的應(yīng)用》——黃燕霞、周非凡、周婷、許皓、林丹櫻、屈軍樂(lè)

《Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection 》——《Nature Methods》

《世界首次！北大研制空間站雙光子顯微鏡獲取航天員皮膚三維圖像》——北京大學(xué)

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