熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

熒光顯微鏡激發(fā)熒光的方式：按光的波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。

UV激發(fā)法是用短于400nm外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見(jiàn)的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。

BV激發(fā)法是以404nm、434nm為ZX的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，所以熒光顯微鏡的截止濾光片要使用可完全阻斷藍(lán)光并可充分通過(guò)所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對(duì)于激發(fā)光的很大吸收波長(zhǎng)和熒光的很大發(fā)光波長(zhǎng)比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片要使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。其缺點(diǎn)是500nm以下的熒光無(wú)法看到，而500nm以上的使整個(gè)圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來(lái)判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時(shí)，上述BV激發(fā)法的缺點(diǎn)往往影響很大。

綜上所述，熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長(zhǎng)按以下三點(diǎn)考慮。

①?gòu)臒晒庀竦姆床钜髞?lái)看，UV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明Z好。

②以像的亮度來(lái)考慮，BV激發(fā)濾光片暗場(chǎng)觀察效率Z高。

③UV激發(fā)濾光片暗場(chǎng)觀察和BV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明的特性，可看作介于這兩種照明方法之間，但前者濾光片暗場(chǎng)的性質(zhì)較強(qiáng)，顯示圖像較明亮，反差小;后者因保留暗場(chǎng)光路的性質(zhì)，故顯示圖像較暗，而反差有所改善。當(dāng)實(shí)際使用熒光顯微鏡時(shí)，應(yīng)采用Z適合標(biāo)本要求的照明法進(jìn)行觀察。

要指出的是，即使像反差Z佳的UV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明，由標(biāo)本折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會(huì)進(jìn)入物鏡，這樣在光學(xué)系統(tǒng)中的加拿大膠膠合面和光學(xué)玻璃因激發(fā)引起的自身熒光會(huì)使像的反應(yīng)變壞。因此，在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片。